植物组织培养即植物无菌培养技术,是根据植物细胞具有全能性的理论,利用植物体离体的器官、组织或细胞,如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下,能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根,最后形成完整的植株。至今,世界各国在无性系繁殖、花卉育种、植株脱病毒和种质保存等方面,广泛应用组织培养技术。
(一)组织培养技求的应用
1.无性系繁殖无性系繁殖是植物组织培养应用的主流之一,用植物组织培养进行无性繁殖的优点是,用材少,速度快,不受气候、季节、基质等自然条件的影响,比传统的常规繁殖方法要快得多,人们又叫它"快速繁殖"或"微型繁殖"。其常见繁殖方式有短枝扦插、芽增殖、原球茎、器官分化和胚状体发生。其中芽增殖在盆栽花卉繁殖中应用最为普遍,如草本植物四季秋海棠、鸡冠花、万寿菊、长春花,观叶植物蟆叶秋海棠、网纹草、花叶芋、天鹅绒竹芋,木本植物三角花、比利时杜鹃、月季、八仙花等,在生产实践中,均已取得较好的经济效益。原球茎培养在大花蕙兰、蝴蝶兰、美丽兜兰、石斛、春兰等兰科植物和肾蕨、凤尾蕨、鹿角蕨等观赏蕨的规模性生产中得到广泛应用。胚状体培养,据报道目前已在30个科150种植物上观察到它们的愈伤组织可以分化出胚状体,而盆栽花卉中的花叶芋、山茶花都是成功的范例。器官分化主要是从外植体直接产生不定芽或不定根,一般不通过从愈伤组织进行器官分化形成植株,因为其性状有可能发生变化或经过多次继代培养后,会丧失再生植株的能力。
2.花卉育种当今盆栽花卉育种中,也广泛应用组培技术。
胚培养:在花卉种间杂交或远缘杂交中,有时虽然能正常受精,但胚往往发育不完全或胚与胚乳间不亲和,不能得到种子,可采用胚的早期离体培养促使胚正常发育,培养出杂交后代。如山茶花、百合和鸢尾杂交中均采用幼胚培养,成功地收到了杂交种子。同时,在杂交中受精困难,也可把未受精的胚珠分离出来,在试管内用花粉受精来解决,这在草本花卉花菱草中已取得成功。
单倍体育种:利用花药培养诱导花粉形成单倍体,在试管培养中通过秋水仙素处理,使染色体加倍,而成为纯合二倍体植物,从而缩短新品种育种的时间,还有利于突变中隐性突变的分离。这在花卉的株型、花色、花型的大小或重瓣,叶型、叶色等产生变异,往往有直接利用价值。这在矮牵牛的育种中已应用。
体细胞杂交和植物基因工程:利用原生质体遗传操作技术,可以从原来不大可能进行杂交的不同属植物间获得体细胞杂种或核质杂种。可以通过摄取外源目的基因,定向改造植物的某些重要性状。
3.植株脱病毒用无性繁殖方法来繁衍的花卉种类如菊花、香石竹、郁金香、百合、白鹤芋等,不能通过种子途径去除病毒,用化学方法防治和高温处理往往成效不稳定。作为组织培养的无性繁殖材料,最好是去病毒组织,否则易导致病毒积累,危害加重。而植物的茎尖部分无维管束,病毒难以侵入。所以,茎尖培养是获得无病毒植株的最好途径。至今,茎尖培养脱毒法已在菊花、百合、香石竹、郁金香等盆栽花卉上推广使用。
4.种质保存用无性繁殖的植物,因没有种子,只能在植物园内长期栽培保存,耗费大量的土地和劳力。种质材料还易受自然环境的变化和病虫危害而流失。若用组织培养方法,保存愈伤组织、胚状体、茎尖等组织,可节省大量人力和物力。
(二)组织培养的几个步骤
1.材料的选用一般用于组织培养的材料称为外植体。常分为两类。一类是带芽的外植体,如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等,组织培养过程中可直接诱导丛生芽的产生。其获得再生植株的成功率较高,变异性也较小,易保持材料的优良性状。另一类主要是根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。这一类外植体需要一个脱分化过程,经过愈伤组织阶段,再分化出芽或产生胚状体,然后形成再生植株。
外植体的取用与组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态、质量,都对培养时器官的分化有一定影响。一般阶段发育年幼的实生苗比发育年龄老的栽培品种容易分化,顶芽比腋芽容易分化,萌动的芽比休眠芽容易分化。在组织培养中,最常用的外植体是茎尖,通常切块在0.5厘米左右,太小产生愈伤组织的能力差,太大则在培养瓶中占据空间太多。培养脱毒种苗,常用茎尖分生组织部,长度为0.1毫米以下。
2.外植体的消毒植物组培能否取得成功的重要因素之一,就是保证培养物在无菌条件下安全生长。为此,必须抓好外植体的消毒和实行无菌操作。
由于培养的植物材料大都采集于田间栽培植株,材料上常附有各种微生物,一旦被带入培养基,即会迅速繁殖滋长,造成污染,培养失败。所以培养前必须对外植体进行严格的消毒处理,消毒的尺度为既能全都杀灭外植体上附带的微生物,但又不伤害材料的生活力。因此,必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序。目前,常用的消毒剂有次氯酸钙、氯化汞、次氯酸钠、双氧水、酒精(70%)等。具体消毒方法如下:
(1)茎尖、茎、叶片的消毒消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将尘埃刷除,茸毛较多的用皂液洗涤,然后再用清水洗去皂液,洗后用吸水纸吸干表面水分,用70%酒精浸数秒钟,取出后及时用10%次氯酸钙饱和上清液浸泡10~20分钟。或用2%~10%次氯酸钠溶液浸泡6~15分钟。消毒后用无菌水冲洗3次,用无菌纱布或无菌纸吸干接种。
(2)根、块茎、鳞茎的消毒这类材料大都生长在土中,常带有泥土,挖取时易遭损伤。消毒前必须先用净水清洗干净,在凹凸不平处以及鳞片缝隙处,均用毛笔或软刷将污物清除干净,用吸水纸吸干后,在70%酒精中浸一下,然后用6%~10%次氯酸钠溶液浸5~15分钟,或用0.1%~0.2%氯化汞消毒5~10分钟,最后用无菌水清洗3~4次,用无菌纱布或无菌纸吸干后接种。
(3)果实、种子的消毒这类材料有的表皮上具有茸毛或蜡质,消毒前先用70%酒精浸泡几秒钟或2~10分钟,然后用饱和漂白粉上清液消毒10~30分钟或2%次氯酸钠溶液浸10~20分钟,消毒后去除果皮,取出内部组织或种子接种。直接用种子或果实消毒,经消毒后的材料均须用无菌水多次冲洗后接种。
(4)花药、花粉的消毒植物的花药外面常被花瓣、花萼包裹着,一般处于无菌状态,只需采用表面消毒即可接种。通常先用70%酒精棉球擦拭花蕾或叶鞘,然后将花蕾剥出,在饱和漂白粉上清液中浸泡10~15分钟,用无菌水冲洗2~3次,吸干后即可接种。
3.组织培养的条件接种后的培养容器置放培养室,室温应控制在23~26℃,每天12~16小时光照,光照度为1000~3000勒克斯。
4.外植体的增殖接种后的外植体要分化出丛状芽、愈伤组织或胚状体,必须对培养基及激素的种类和浓度进行严格的设计和筛选。常用的基本培养基为MS培养基,激素的种类和浓度对外植体的分化和增殖起到重要的作用。也就是说不同的花卉种类对激素的种类和浓度是有差别的(表4--3)。
5.诱导生根继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根,要促使试管苗生根,必须转移到生根培养基上,生根培养基一般应用1/2MS培养基,因为降低无机盐浓度有利于根的分化。同时,不同盆栽花卉诱导生根时所需要的生长素的种类和浓度是不同的(表4-4)。一般常用吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和吲哚丁酸(IBA)三种。一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。
6.组培苗的移栽生根或形成根原基的试管苗从无菌,温、光、湿度稳定环境中进入到自然环境中,从异养过渡到自养过程,必须经过一个炼苗过程。首先打开试管瓶塞放阳光充足处让其锻炼1~2天,然后取出幼苗用温水将琼脂冲洗掉,移栽到泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等组成的基质中,基质使用前需高温消毒,移栽后要适当遮荫,可用塑料薄膜覆盖,保持较高空气湿度,温度维持在25℃左右,勿使阳光直晒,7~10天后要注意通风和补充浇水,约20~40天,新梢开始生长后,小苗可转入正常管理。
外植体选取从生长在田间或盆栽的优良品种植株上,选取生长健壮、无病虫害的当年生枝条的茎尖和幼茎。取材最好在晴天正午,并且取用植株上部的幼茎。阴雨天或靠近地面的幼茎,表面污染较为严重,难于消毒。玫瑰除用茎尖和幼茎做外植体外,也可以用叶片、叶柄、根、茎、原生质体、胚、花药、子房、花萼和花托做外植体。
消毒灭菌及无菌苗的建立取玫瑰外植体,用5%~10%的次氯酸钠浸泡10~30min或用01%~02%的HgCl浸泡5~15min。用无菌水清洗7~10次后接种。也可先用75%的酒精浸泡20~30s再采用上述方法消毒。消毒灭菌完毕后,将幼茎切割成05~10cm长的至少带有一个节的切段,接种于培养基中。
凤仙是凤仙花科凤仙花属多年生常绿草本植物。新几内亚凤仙是凤仙花家族中的一个新品种。它花色丰富,四季开花,花期长,叶色独具特色,作为周年供应的时尚盆花,日益受到了人们的青睐。它的传统繁殖方法是通过播种繁殖,但播种繁殖需要恒定的温度,而且种子价格比较昂贵,发芽率低。近年来,用无性繁殖,利用组织培养技术,既可以在短期内取得大量的优质脱毒苗,又可避免因常规无性繁殖而导致的种性退化。具体可用新几内亚凤仙的茎段作为外植体,对其进行离体快速繁殖。
材料与方法
试材处理
从新几内亚凤仙植株上剪取带有腋芽的嫩梢,去掉叶,先用自来水冲洗10分钟,再用洗洁剂溶液洗涤1-2次。在无菌条件下,依次用70%的酒精浸泡30秒钟,2%的次氯酸钠浸泡12分钟,无菌水冲洗3-5次。最后将处理好的嫩梢切成每个节间约0.5cm长的带芽茎段接种在预制好的初代培养基上。
培养条件
分化培养基的选择 以MS作为基本培养基,分别设置BA0.5、1.0、1.5、2.0 mg /L,NAA0.2、0.4、0.6、0.8mg/L各4种浓度,共16个组合。筛选分化培养基中BA和NAA最佳组合,3次重复。各培养基组合均加入蔗糖3%-4%,琼脂6-8g,Ad30mg/L,调PH值为5.8。
生根培养基的选择 以MS为基本培养基,设置IBA0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mg/L5种浓度,摸索最佳生根条件。各培养基均加入蔗糖2%-2.5%,琼脂6-8g,调PH值为5.8。
继代培养
新接的外植体约30天萌发成苗,苗高2-3cm时,将小苗剪成0.5cm长带芽茎段,放入分化培养基中继代培养。
生根培养
小苗高3cm左右时,从基部剪下,接种于生根培养基上,进行生根培养。
小苗移栽
小苗生根培养根长达2cm时,进行移栽,先移入温室中炼苗1-2天,温室中培养2-3周后上盆。
结果与分析
不同浓度的BA和NAA组合对新几内亚凤仙分化出苗的影响
以MS作基本培养基,4种浓度BA和4种浓度NAA组合,对新几内亚凤仙出苗影响见表1。
结果表明:芽的增殖和嫩梢的增长不仅取决于BA、NAA的绝对数量,而且取决于二者相对比例。浓度最大BA/NAA条件下,繁殖系数17达最大,而且嫩梢生长度也达到最大1.23,浓度最小BA/NAA条件下,繁殖系数、嫩梢长度之比为10/0.67,二者绝对值处于中间状态。综合芽的形成和嫩梢生长两种情况看:高浓度的BA(1.5-2.0mg/L)与NAA配合时,嫩梢生长较正常,平均株高1.09cm,增殖倍数为14,较低浓度的BA(0.5-1.0mg/L)与NAA配合时,繁殖系数为8.9,平均株高为0.68cm,长势不良,实验条件下以BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L效果为最佳。
不同浓度的IBA对生根的影响
以MS为基本培养基,5种浓度IBA条件下生根效果见表2。
结果表明:开始生根天数随IBA浓度加大而缩短,IBA浓度从0.3-0.9mg/L范围内,随浓度加大,生根率、每株根数增加,超过0.9mg/L,生根率下降。且多形成粗大根,产生愈伤组织或从愈伤组织上再生根。实验条件下,以0.9mg/L生根效果最好,生根较快,根系生长正常,根数较多。
小苗移栽
已生根小苗经20天,待根长达2cm时,取出试管苗,洗去根上琼脂,移至透水通气的蛭石中,先在培养室中温度20℃-25℃,相对湿度65%-75%条件下培养2-3周,然后移至散射自然光下炼苗1-2周,最后上盆进入温室,成活率可达95%以上。这期间除了注意保温保湿外,土壤湿度不宜太大,温度以23℃-25℃为好,注意采用杀菌剂保护,避免幼苗腐烂死亡。
结论
MS+BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+Ad30g/L+蔗糖3%+琼脂8g/L,调PH值为5.8是新几内亚凤仙茎段培养较为理想培养基。继代培养天数约为30天左右,繁殖系数可达17,嫩梢生长正常。
在MS+IBA0.9mg/L+蔗糖2.2%+琼脂7g/L,调PH值为5.8的培养基上,新几内亚凤仙试管苗生根效果较好,生根率可达95.4%,根系发达,植株生长旺盛。
生根两周后的试管苗尚需炼苗2-3天,经培养室移植培养2-3周,自然光下1-2周炼苗可上盆入温室,成活率达95%以上,小苗成活关键是基质选择及温、湿度控制。
杜鹃花为杜鹃花科杜鹃花属常绿或落叶小灌木,具有品种多、开花早、花色丰富、花期长等特点。近几年,由于扦插繁殖技术的发展,我国杜鹃花产量有了提高。但是,名贵品种因母本少、繁殖系数低,仍不能满足社会需要。而组织培养正是实现杜鹃花工厂化育苗的有效措施。下面将其简单介绍如下:
一、杜鹃花组培的基本技术环节
杜鹃花组织培养,通常使用的外植体为茎尖、茎节和花蕾等。因花蕾的分化较为困难,周期长;茎尖的取材受到一定限制,故国内多采用茎节为初代培养的外植体。
杀菌处理时,杀菌能力较强的升汞(氯化汞)易造成外植体材料的褐变死亡,不宜使用。试验表明,采用饱和的次氯酸钙液上清液或5%的次氯酸钠液作为灭菌剂,效果较好,处理时间为15至20分钟。为加强灭菌效果,还可加入1%的克菌丹或0.1%的吐温-20(山梨糖醇)配合使用。材料灭菌前的预处理,通常采用70%酒精浸泡,不超过30秒。此外,用中性洗涤剂进行材料的预处理,亦可有效降低其灭菌后的污染率。外植材料灭菌流程为:洗衣粉液浸泡20分钟?流水冲洗至清?70%酒精浸泡30秒?灭菌水冲洗1分钟?5%次氯酸钠浸泡15分钟?灭菌水漂洗3次,每次1分钟。如此,可将外植体污染率降低到15%以下。
杜鹃花组培所用培养基,为Andeson改良MS培养基:将MS培养基中的硝酸铵和硝酸钾用量分别减至1/4,取消了碘化钾成分,铁盐的用量增加一倍。因杜鹃花科植物原产于高山酸性土壤,培养基的pH值宜为5.0至5.4。培养室温度25℃,光照强度3000勒克斯,光照时间12至14小时。
杜鹃花在诱芽培养中使用的激素较一般植物有异,需要活性较强的细胞激动素类物质,才能达到满意的效果。试验表明,使用ZT的诱芽效应最为显著;添加KT的处理几乎无丛芽或侧芽发生,仅是原茎尖的伸长;而选用6-BA处理,则导致培养材料的褐变加剧,效果反不如对照。此外,在其后的增殖培养中,杜鹃花对细胞激动素种类的要求,仍以添加ZT为好。
国外在杜鹃花的组培中多使用2ip作为外源细胞激动素,效果较ZT好。但从经济的角度考虑,仍推荐使用ZT。
二、杜鹃花的初代和继代增殖培养
杜鹃花初代诱芽培养,NAA浓度不得超过0.1mg/L,ZT用量的增大对诱芽效应有明显促进作用。但提高ZT浓度时,NAA浓度不宜同步增加,ZT/NAA值较大为好。从经济培养的意义出发,初代培养的激素配比以ZT5+NAA0.01(mg/L)为宜,培养1个月左右时,诱芽率即可达100%,诱芽系数6.5。
杜鹃花继代增殖培养,对细胞激动素要求比初代培养有所下降。虽然增殖效应仍随ZT用量的增加而上升,但已不如初代培养时那么明显。此外,用于增殖培养的材料性质不同,其增殖效应也不尽相同,品种间亦存在显著的差异性。供试品种中,‘小桃红’以采用丛芽为增殖培养体时的增殖系数较高(7.6);而‘花春雨’则反之,以取用芽条时的反应为佳(7.5)。
杜鹃花组织培养,从接种到诱芽产生,所需的时间明显长于月季和菊花等,故其继代增殖培养的周期也较长。试验中分别以30天和45天为培养周期进行了统计,在各激素水平配比处理中,其增殖芽总数,培养45天要比培养30天的高出50%至80%。所以,杜鹃花组培过程中,过于频繁地切割、转换培养,反达不到快繁的目的。
三、试管苗的生根培养及移栽
杜鹃花的生根培养虽不十分困难,但对培养基的要求仍与一般植物不同。其一,基本培养中无机盐大量元素的用量不能减半;其二,蔗糖的用量仍为30g/L,生长素NAA的添加量以1.5至2.0mg/L为好,培养45天时的生根率为60%左右。
供生根培养的试管苗,要求高15厘米以上,具7片以上真叶,发育健壮。生根培养2周后始见发根,6周时达最高生根率。试验中曾发现,在增殖培养过程中用KT或6-BA取代ZT时,虽诱芽、增殖效应较差,但芽条发育较粗壮。因此,在增殖培养达到一定群体数量后,用KT或6?BA进行继代培养处理,可使生根率和移栽成活率明显提高。此外,在生根培养基中添加2g/L的活性炭,可使试管苗个体发育显著增强,1个月后生根率可达到90%以上。
国外的研究资料表明,某些常规繁殖(扦插)极难生根的植物,经组织培养后获得的试管苗,生根会容易很多。有些可不经生根培养直接移植到生根介质中,生根率可达100%,3至4周后即可移入温室进行盆栽。这种生根介质为泥炭土、蛭石、珍珠岩的混合物,pH以4至4.5为宜。
生根试管苗的移栽入土,栽培基质为1∶1的泥炭生+蛭石混合物。表层要求过筛,以利根系附着;下层铺粗粒,以利基质渗水。移栽时用镊子去掉根部附着的培养基(不可损伤根系)。用镊尖将基质拨一小洞,把根系放入,覆土,轻轻压实,浇足水。试管苗移栽成活的关键是保证一定的温、湿条件,移栽环境和试管培养时的条件相差悬殊,常造成移栽苗生长不适或死亡。
试管生根苗的移栽虽然在全年均可进行,但在不具备生根室的情况下,仍以春、秋两季进行较为稳妥方便。
四、组培技术在杜鹃花新品种选育中的应用
试验初期,鉴于杜鹃花外植体灭菌困难,可供试验的接种群体太小,不能满足正常试验的进行。为尽快筛选出合适的培养基配方及相应的培养条件,笔者结合杂交育种,采用杂交种子试管发芽的方法,再用试管实生苗的上胚轴为外植体进行研究,取得了事半功倍的效果。笔者发现,杜鹃花的杂种实生苗常规播种繁殖需3至5年才能开花,而经上胚轴培养的杂种实生苗,移栽后第二年即可开花,大大缩短了杂种实生苗的童期,对加快显花、结果类植物的育种进程具有重要意义。
一般来说,种子的灭菌处理较其他器官或组织容易得多。杜鹃花杂交种子的灭菌处理为:70%酒精表面浸泡1分钟,灭菌水漂洗后转0 .1%升汞液浸泡10分钟,灭菌水漂洗3次,每次1分钟以上。灭菌后再剖实取籽、接种培养,接种两周始见发芽。出苗后取用上胚轴进行诱芽快繁,繁殖系数较高。成苗后,可取茎尖或茎节再培养,培养条件和方法同前。国内组织培养涉及新品种选育的不多,特别是在观赏园艺植物方面。从发展的角度看,组培技术要保持较强的生命力,就不该离开新品种的选育。因此,有机地将组培技术与杜鹃花新品种选育结合起来,对提高绿地植物景观的建设水平、促进杜鹃花的产业化发展,都是十分有益的。
杜鹃做为一种高档花卉在华北繁殖及养殖并不容易。主要由于华北土壤大都呈
碱性,而杜鹃喜欢典型的酸性土壤,因而在繁殖和栽植上有一定的困难,只能做为温室棚栽花卉。杜鹃繁殖有播种、扦插、压条及嫁接、组织培养等几种。组织培养不需种子,只要用杜鹃的当年生的枝条的茎尖就可以了,在很短的时间里就可在试管里培养出大量的小杜鹃苗,而且它不受季节的限制,在冬季里也可培育杜鹃苗。
方法:首先,采取杜鹃当年生嫩枝顶芽,把它放在自来水下冲洗5 min,再把它放在烧杯里,然后倒入洗净液,并加入适量的水,用小毛刷搅拌,重复2次,然后用清水冲洗干净,把冲洗干净的茎尖再放入75%的酒精中浸泡1 min,在无菌超净工作台中用无菌水冲洗4~5次,再用0.1%升汞浸泡3 min,然后再用无菌水冲洗4~5次,最后接种到分化培养基中。其分化培养基为改良MS培养基,其培养基是去掉KI,调节NH4+与NO3-的比例,由原来的1∶2变为1∶1,pH值为5.0~6.5之间。
MS(改良)+6BA1.0-2.0(mg/l)+NAA(0.1~0.5 mg/l)
1个月后在其茎尖上分化出丛生芽。20 d后长成丛生苗,切取丛生芽,接种在生根培养基上,15 d后即形成白色幼根,20 d后根长2~3 cm,生根培养基为:
MS+IBA1.0~2.0 mg/l+NAA0.1~0.5 mg/l当杜鹃小苗在试管中生长20 d根长2~3 cm左右时,即可把试管苗移入温室大棚中炼苗,使试管苗适应外界环境,当试管苗在大田中炼苗4~5 d左右,把杜鹃小苗从试管中轻轻取出,放在其水温为25℃,pH值为5.0,01%溶液的多菌灵溶液中冲洗掉细根上的琼脂,
然后栽植在腐殖质土、苔藓、山泥以2∶1∶7的混合土质中。在大棚中盆栽需注意排水、浇水、喷雾等工作。当天移栽出的小苗要施一次肥,施肥时注意宜淡不宜浓,因为杜鹃根极细,施浓肥容易烂根。在菏泽地区,水多为碱性,故应适时浇矾肥水。矾肥水是用3 kg硫酸亚铁、香油渣5 kg、豆饼5 kg加水200 kg配成,必须经腐熟后即可稀释浇用。当杜鹃开花后要求适当增加氮肥,在夏季要适当地遮荫。
竹节秋海棠是秋海棠科秋海棠属的一种多年生常绿草本花卉,其花朵繁多,花色娇艳,花期特长(4——6个月),又较耐阴,适于栽培观赏,深受养花人的喜爱。但竹节秋海棠分株能力弱,茎段扦插成活率低,繁殖速度慢,性状易变异,无法满足市场需要。本文探讨的叶、叶柄、茎段为外植体的组培快繁技术,操作不受季节限制。通过组织培养,直接培育成再生植株,繁殖速度快,繁殖系数高,遗传性状稳定。并在壮苗生根阶段首次尝试用液培,效果甚是理想。液培苗粗壮,根系发达,移栽更易成活。出瓶、生根不易伤根,免受污染,洗苗、洗瓶也都更省工。我室出瓶移栽的竹节海棠苗,经半年种植,已正常开花。这为竹节秋海棠的快速繁殖提供了一条可靠而有效的途径,同时对其他植物的快速繁殖也可能有一定参考价值。现将竹节秋海棠组培快繁技术介绍如下:
一、植物名称
竹节秋海棠(B.President-carnot)
二、材料类别
叶片、叶柄、茎段
三、培养条件
以MS为基本培养基。诱导愈伤组织培养基:(1)MS+BA3——5mg/L(单位下同)+NAA0.1——0.5。丛生芽增殖培养基。(2)MS+BA1.0+NAA0.1。(3)MS十BA0.5十NAA0.1。(4)壮苗培养基:1/2MS(液体)。(5)诱导生根培养基:1/2MS +NAA0.2。上述培养基均加3.0%蔗糖、0.8%琼脂,pH值5.8。培养温度(24±2)℃,光照不宜过强,有80Olx左右即可,光照10h/d。
四、生长与分化情况
(一)无菌材料获得 将竹节秋海棠已平展之幼嫩叶片、叶柄、茎段先用适量洗衣粉对水洗涤,然后用自来水反复冲洗,于无菌条件下用75%酒精药棉擦拭干净,放于饱和漂白粉溶液10分钟,后置于0.1%升汞溶液中消毒2分钟,用无菌水冲洗5——6次,消毒滤纸吸收干表面水分,叶片切成0.5cm见方小块,叶柄、茎段则切成约长1cm左右长条,均接种于培养基(1)上。
(二)丛芽的诱导与增殖 接种、培养1周后,叶、叶柄、茎段周围开始膨大、增厚,质地变硬,逐渐形式黄绿色愈伤组织,3周后渐渐分化出小芽点,芽点继续生长,约5周左右形成明显的丛生芽。将丛生芽切成小块,接种于(2)和(3)培养基上进行增殖,小芽丛上不断分化出很多幼芽。叶、叶柄、茎段在两个培养基上增殖速率基本相同,约4周左右继代1次,增殖系数可达6——9。
(三)壮苗 在进行大量增殖阶段后,我们停止固体培养而改为液培,将分化芽转接到1/2MS,3周后,可发现生长健壮、个体粗壮的无根苗。这为以后生根、移苗出瓶,提高适应外界环境,增强抗病能力,提供了良好条件,移栽更易成活。
(四)根的诱导 将高约3cm、生长健硕的无根壮苗,接种到培养基(5)上。2周后,苗基部长出辐射状白色小根,每株生根5——7条,3周后,根伸长至1.0——1.5cm,生根率达100%。
(五)试管苗的移栽 将培养有试管苗的三角瓶盖打开,在实验室通风处炼苗3d,取出小苗,洗去根部残留培养基,种植前根部在0.2%Na2SO4溶液中滞留片刻。移栽到用高压灭菌消毒过的蛭石+细沙+园土(1:1:1)的混合基质中,地上部喷施0.1%多菌灵溶液,用薄膜覆盖,每天喷水2次,1周后揭膜,成活率在95%以上。
中国兰新芽生长期正值南方高温高湿的多雨季节,杂菌繁衍猖獗,土壤、介质中带菌尤为严重。供接种取样的兰盆介质应尽少带杂菌,不施有机肥,放置在透光避雨处,当新芽初露时即让幼芽裸器上面。取6~13cm长的新芽,从植株基部切高,用刮刀除去根、赃物和外包叶2~3片,充分洗净后将材料再切取2~3cm长,在10%次氯酸的药液中消毒10分钟。如带菌严重,应用0.I1%升汞和饱和漂白粉上清波交叉消毒。灭菌后用无菌水冲洗数次,再放到灭菌滤纸上吸干水许,然后在解剖镜下无菌操作利取茎尖和腋芽。如果以去病毒为目的,所剥取的茎尖应在O.2mm以下,否则可剥取2mm以上茎类,带2个叶原基,有利于成活。
(一)、原球茎的诱导
兰花各个部分的离体组织部能诱导形成原球茎,再经分化培养形成植株。一旦形成原球茎后,就能不断分割继队培养增殖起来,也就是建立了无性繁殖系。兰花的原球茎生命力强,遗传性状稳定,对快速繁殖及种质资源保存极为有利。
外植体接种后放置在23一25度的黑暗条件下培养,1~2十月后可分比出1至数个乳白色的原球茎,在解剖镜下观察类似桑果形状的园球突起,以后转绿,再经培养易呈根状茎(或呈树枝状的丛生形),。影响兰花原球茎诱导成功的因素有:
1、品种的影响:不同品种由于遗传类型、内源激素和多酚类物质含量等囚素的差异,诱导启动的难度也不尽相同。
2、培养基的影响:各品种对不同培养基的适应程度不一样。春兰类品种以White+BA;+NAA5+CM8.5%和B11+BA+NAA2为好。夏蕙、秋素等则以MS+BA0.5+NAA1十活性炭0.5%的培养基为好。初步观察,春兰品种适应以无机盐浓度和氨态氮含量低,而生长素含量高的培养基。夏蕙、秋素等品种则适应无机盐浓度较高、生长素含量较低的培养基。
3、新芽氏度及材料类别的影响:茎尖无论启动率和成功率均高于测芽以9~13公分的新芽诱导,成功率最高。
4、诱导启动后褐变死亡的影响:国兰品种的茎顶接种后成活并膨大呈桑果状原球茎因为启动,成功率尚好,但启动后容易褐变死亡,是国兰组培失败的原因之一。据四川农科院生物技术研究所的资料,褐变死亡数几乎占3/4。由于国兰芽端具有较多的多酚氧化酶,经茎项培养易褐化而死亡,如采用较大的外植体接种,降低培养温度、暗培养、尽量减少伤口面以及在培养基中附加褐变抑制剂(常用抗氧化剂,如芸香苷,柠檬酸等),或配合应用活性炭等,有减轻褐变死亡的效果。
(二)、兰科植物多通过原球茎途径分化形成植株。热带兰原球茎多呈园球状,国兰的原球茎则呈丛生状(根状茎)。原球茎形成阶段是兰花大量繁殖的有利阶段,是快速繁殖,提高增殖率的重要环节。茎尖,侧芽接种3~6个月后,根状茎形成时即可分割继代,增殖培养基以W和B11为基本培养基,附加NAA1~2的液体培养基为宜。放置在漫转速转床上加光培养(1~2转/分),每隔15天更换一次培养基,连续继代3~4次后,又转入相同成分,附加有活性炭(0.3%)和柠檬酸(500mg/1)的固体培养基,每月继代一次。液培、固培交替进行。增殖培养中,原球茎的分割不可太小;培养群体不宜太少;培养液则不可过多;继代培养时间不可太长,否则原球茎生长不良,甚至死亡。原球茎可以不断地再分割、增殖,这样就建立了无性系。国兰原球茎的继件次数和时间还有待探索,但从已继代3~5年的原球茎来看,仍保持正常的增殖和分比能力。
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